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JTD杂志|谭强教授挑战胸外科的哥德巴赫猜想

Published at: 2015年第1卷第S1期

谭强 , 罗清泉 , 赵珩
关键词:

“组织工程化气管由此被誉为外科界的哥德巴赫猜想,是一个终极梦想。”

导语

1997年,曹谊林教授成功的在裸鼠背上构建了耳廓状软骨。此报道一出,公众疯狂了,人们甚至天马行空地在脑袋里构建“人体器官工厂”的模型,“组织工程学”也由此进入大众视野。可时至今日,“人造器官”仍未应用于人体,主要的发展障碍在于组织工程器官再血管化,由此衍生出的排异问题。上海市胸科医院胸外科副主任医师谭强,多年前便开始投入组织工程化气管的研究。他最早提出组织工程领域的新概念:“体内生物反应器”。谭主任表示,组织工程器官就好比外来部队,“体内生物反应器”好比一座营养补给站,保证外来器官植入人体后持续获得补给,提高植入成功率。

近日,由谭强,柳瑞军,陈小科,吴镜湘,潘银根,陆舜,沃特.韦德,罗清泉共同完成的论文 Clinic application of tissue engineered bronchus for lung cancer treatment 在最新一期 JTD 杂志作为封面文章发表,以下是谭强等人对于“外科的哥德巴赫猜想”的精彩阐释,点击文末“阅读原文”可进入 JTD 官网查看英文版论文。

组织工程化气管临床应用

作者 | 谭强、罗清泉、赵珩,上海市胸科医院胸外科

首发平台:CTOP

图片来源:见水印

版权声明:本文已征得作者同意转载

2016年1月,瑞典SVT电视台专题纪录片,曝光瑞典卡罗林斯卡学院外科医师Paolo Macchiarini涉嫌夸大组织工程化气管相关临床试验结果,直接导致诺贝尔委员会秘书长Urban Lendahl引咎辞职。组织工程化气管再次成为热门话题,那么什么是组织工程技术,该技术是否可能应用于气管替代品的构建?

 
瑞典卡罗林斯卡学院外科医师Paolo Macchiarini

时间回溯到上个世纪80年代的某一天,哈佛医学院麻省总院儿科医师,Joseph Vacanti,突发奇想将体外培养的软骨细胞团块接种在裸鼠皮下,希望能再生软骨组织。异位接种的细胞团块很快被吸收了,不论Vacanti如何增大细胞数量,结果都令人沮丧。机缘巧合,他遇到了麻省理工学院材料系的Robert Langer教授,后者提议将细胞接种在可降解的三维支架材料上,模拟体内组织的三维结构,维持细胞正常功能。试验获得了成功,1990年相关成果发表在Science杂志,Vacanti将该技术命名为组织工程学,他和Langer教授被尊称为组织工程之父。(1)组织工程技术真正进入大众的视野,归功于1997年,曹谊林教授成功的在裸鼠背上构建了耳廓状软骨。公众疯狂了,科学界也乐观的预言,人类即将告别器官移植时代,进入到组织器官再生的新纪元。然而接近20年过去了,那只耳朵依然只长在裸鼠的背上,到底是哪里出了问题?

 

让我们首先从技术层面剖析下,组织工程技术的核心是细胞三维培养技术。 传统的组织工程培养技术,首先将细胞接种于可降解的三维支架上,该支架可按需要修复的缺失形状精确塑形,再将细胞-支架材料复合物放入生物反应器中,模拟体内再生微环境长期三维培养,待组织器官成熟成型后,接种入体内实现功能替。理想很丰满,现实很骨感,该经典方法在实际操作中,遇到了许多问题,主要包括以下几点:

1 缓慢的再血管化过程阻碍大尺寸组织工程替代物的临床应用

传统的组织工程技术可分为两个完全独立的步骤,组织工程化替代品体外三维培养,以及替代品植入体内后与周围正常组织的融合再生过程。最初的计划是在组织工程替代品中重塑一套血管系统,类似器官移植一样在植入时连接到受体的血液循环系统,实时的血液循环建立避免了种子细胞的死亡,使得组织工程化替代品及时发挥功能。事实证明要在体外培养的组织工程器官里重建毛细血管网还存在相当大的困难。(2-3)前期研究证明,没有可对接内置血管系统的组织工程化替代物植入后的营养依赖于周围的组织液渗透与血管原位生长。这样的血管再生过程需要几周。移植后,组织工程替代物的内部分会由于组织缺血缺氧、导致大批种子细胞坏死,而产生毒素危害局部再生微环境。(4-5)内置血液循环系统的缺位质疑了种子细胞预先接种的必要性,导致“原位组织工程”概念的提出,该方法不接种种子细胞,仅植入经过塑型的可降解生物材料和附着其上的生长因子,植入后希望诱导原位干细胞生长分化。(6-7)“原位组织工程”临床应用结果并不成功,证明了种子细胞在组织再生过程中的重要作用。如此,目前组织工程产品的成功应用,仅局限于软骨组织(无血供体系)和皮肤(接种于富含血管的损伤表面),再血管化是组织工程技术的阿喀琉斯之踵(8-9)

2 对正常组织再生过程的了解缺位

生物反应器是组织工程研究中的关键技术之一,它的目的是模仿体内组织再生过程微环境,体外三维培养构建组织工程化组织器官替代品。(10-11)讽刺的是我们目前对正常组织器官的再生微环境知之甚少,体外模拟更是无从谈起。(12-13)耳朵之所以长在裸鼠的背上而不是实验室的烧瓶中,主要的原因就是体外无法完全模拟体内再生微环境,只能利用裸鼠作为活体的生物反应器。即使我们能在体外生物反应器中精确的模拟体内再生微环境,由于上述内部脉管系统的缺失,将导致替代品表面与营养液充分接触的种子细胞材料将快速增殖,从而在替代品表面形成一个致密的组织层,阻碍营养物质向替代品内部的浸润,导致替代品内部种子细胞的死亡,形成仅有外层组织形成内部单纯材料的“中空结构”,替代物的机械强度将大大削弱。植入后由于该类替代品中支架材料的成分超过了预期,生物相容性将减弱。(14)科学家试图在有免疫力的大动物中复制“裸鼠背上耳朵”的实验,体外构建的中空的软骨内部的生物材料降解过程中形成的局部酸性环境,引发了无菌性炎症和免疫排斥反应,导致植入物的吸收。 

3 受体和组织工程器官之间的融合再生反应

组织工程替代物植入后经过再血管化的过程,从而成为受体器官的一部分。最终的再生组织和器官将是体外接种的种子细胞和受体增殖细胞的杂合体。(15) 传统组织工程方法希望模拟正常组织器官超微结构,精确排列不同类别的种子细胞形成功能小体。前期实验表面,在没有独立的循环系统的前提下,无论组织工程替代物中种子细胞结构排列如何精妙,接种后它们都必须经历受体重组,形成新的杂合组织。(16)

4 X如何保证组织工程替代物内部有效的生长因子浓度

各种生长因子的时空表达组合是调节各类细胞的分化和组织再生的关键,遗憾的是我们对之知之甚少。(17-18)即便我们有了各类生长因子相互作用的再生模式图,如何在组织工程化组织器官内部实现对有效浓度的精确控制是必须克服的技术上难题,目前采用的基因转染和生物材料复合生长因子技术,都无法达到精确控制多种生长因子浓度的技术要求。(19-20)

5 缺少对细胞在培养过程和组织器官再生过程实时和定量的监控

例如目前的细胞培养主要依赖技术员的定时观察,形态学的证据为主。由于缺乏对细胞培养过程中各类生长因子及代谢产物实时的精确地监控和调整,导致细胞增殖和分化率的低下。

在宏观了解了组织工程技术背景的基础上,让我们回到主题,传统的组织工程技术是否适合气管替代品的构建?答案是否定的,理由很简单,动物试验证明,当我们切断2公分以上的气管,即便马上原位缝和替代,长期观察发现该段自体气管替代品(组织工程技术的终极梦想),也将发生缺血坏死,导致软化或肉芽组织增生阻塞气道。

自从2008年,三例组织工程化气管临床应用发表于《柳叶刀》杂志,代表了该领域研究的技术发展水平。(21-23)首例病例利用脱细胞同种异体气管作为生物可降解支架材料,将自体上皮细胞和由间充质干细胞诱导分化的软骨细胞分别接种于材料的内外表面,种子细胞-支架材料置于生物反应器内在体外培养。4天后置换一位30岁患肺结核女病人的5厘米主支气管。第二例涉及一位36岁气管肿瘤患者,可降解支架材料为纳米复合材料聚合物,该病例采用形成所谓的“再生能力促进策略”,即植入后给患者全身应用生长因子,旨在动员骨髓干细胞,并保持再生所需有效生长因子浓度。 第三例是一名患有先天性长段支气管狭窄12岁男孩, 组织工程化气管替代物由预先接种骨髓间充质干细胞和自体上皮细胞的同种异体器官支架构成,该病例采用系统和局部应用生长因子的方式,并成功随访两年。上述病例报道使人们看到了组织工程化气管临床应用的可行性,极大的促进了组织工程化气管的研究。遗憾的是,三个应用病例中都无法证实体外接种的种子细胞在气管再生过程中的作用,种子细胞只是临时的覆盖还是具备了传代的能力并最终参与了气管再生的过程?“再生能力促进策略”,以及局部和系统性的生长因子应用究竟能在气管替代品内部保持多久的有效浓度? 众所周知,可降解的生物材料、种子细胞和生长因子是组织工程中三个重要因素。如此,上述提及的三个应用实例能否代表组织工程化气管的成功应用,或者只是生物材料替代物起到关键作用,是升级版本的生物材料替代成为了争议的焦点。(24)所以至今仍没有一个广为接受的组织工程化气管材料重建和应用方法。

气管成为组织工程研究的热点基本上源于一个误解,人们一厢情愿的将气管视为单纯的管状软骨,基于裸鼠背上耳廓状软骨的成功经验,管状软骨的构建技术已经成熟,组织工程化气管似乎呼之欲出。(25)事实上气管替代品一直是外科界尚未解决的“哥德巴赫猜想” 。心胸外科的奠基人Belsey教授,早在上世纪50年代就指出:“胸段气管是人体中最后一个尚为臣服于外科医生的单个气管,气管替代品的解决一位着外科拓荒时代的结束。” 然而直到今天, 临床上尚无广泛接受的可靠的气管替代品,缓慢的再上皮化和再血管化是气管替代品急需解决的技术难题。由于气管管腔与外界相通,是一个有菌的环境,具备良好生物 相容性的气管替代品在促进正常气管组织长入再生的同时,也将成为细菌生长的温床。 细菌的生长一方面会刺激肉芽组织的增生堵塞气管管腔,另一方面会进一步向下侵袭肺 组织引起反复发作的致命的肺炎。完整的上皮组织可以阻止细菌的侵犯,控制肉芽 组织的过度增生,并且协助排痰,防止气管阻塞及减少肺炎发生率。前期研究表明快速再血管化是气管替代品快速再上皮化的前提条件,正常气管组织正是依赖于粘膜下层丰 富的毛细血管网,保证代谢旺盛的上皮细胞的更新换代以维持上皮的完整性。解剖学上 气管血供较为特殊,没有较粗大的营养动静脉,而是依靠来源于甲状腺上、下动脉和主 动脉的细小分支在气管环膜交界处外侧形成组织节链,再以分节形式进入气管形成细小 的毛细血管网。气管替代手术中外侧的组织节链极易遭到破坏,气管替代品的血供重建 依靠从正常气管组织中沿两个吻合口断端毛细血管网的长入,前期实验表明该长入过程 十分缓慢,且有长度局限(一般不超过 1 公分)。 鉴于上述原因,临床气管外科手术仍然以受累气管部分切除,气管端端吻合为主。 其切除范围成人不能超出 6 公分,小儿不能超出气管总长度的三分之一。(26)

为了克服上述传统组织工程技术构建气管替代品所遇到的障碍,我们提出了“体内生物反应器”(in-vivo bioreactor)概念, 其基本设计原理是利用可携带式泵系统,在植入的组织工程替代品内部形成持续性营养液灌注,从而将传统组织工程技术中绝对分离的体外细胞-支架材料培养和体内替代品整和过程有机的结合在一起,将这受体视为其自身组织工程组织器官重建再生的生物反应器。

前期体外预实验中,我们验证了该设计的三大优点:(27-30)

  1. 在组织工程化气管支架材料内持续营养液灌注保证预先接种的种子细胞能够存活,包括内部的软骨细胞及表面的上皮细胞。由于“体内生物反应器”设计中中营养液的持续流动,营养物可通扩散与对流进入组织工程替代物内,维持200微米厚度的组织存活。与之相对应的静置培养条件下,营养仅通过灌注被输送,形成的组织层厚度不超过100微米。微量透析检测技术显示“体内生物反应器”设计为组织工程化气管提供了更为稳定的内环境。这个实验同样证实了使用植入式生物传感器来监测原位组织工程替代物的再生过程的可行性。

  2. “体内生物反应器”设计可实现种子细胞的持续性接种

    传统的组织工程方法在植入前接种大量的种子细胞,需要在体外进行大规模的细胞扩展。由于体外尚无法模拟体内再生环境,细胞在体外扩增过程中将出现去分化,无法保持应有的细胞功能。“体内生物反应器”设计从技术上避免了对体外细胞大量的扩增依赖,种子细胞可加入到灌注液中,实现持续性细胞接种。在急症手术中,可先植入支架材料,同时采取适当的组织进行种子细胞分离及体外扩增,再通过“体内生物反应器”定期接 种到组织工程替代品内,从而避免患者的长期等待,一期实现临时功能替代,并逐步增 强完善。将种子细胞分离培养接种贯穿整个组织工程化组织器官替代品再生全过程,尽量减少体外扩增过程对细胞功能的影响,更复合生理功能和临床应有的实际需要。

  3. “体内生物反应器”保持组织工程化组织器官替代品内部生长因子有效浓度

    作为再生组织的重要环节,生长因子的最适有效浓度和各种因子的协同作用在组织工程重建中起到了至关重要的作用。根据传统组织工程技术,在替代物材料中调整各种生长因子的浓度非常困难。举例说明,血管再生是一个包括了各种生长因子协同调控作用的复杂过程。体内生物反应器可以通过调节灌注液中多种生长因子浓度,来稳定地调控其在组织工程化组织器官替代品内部的表达水平。

在动物试验的基础上,依据2009年卫生部颁布的<医疗技术临床应用管理办法>(卫医政发(2009)18号) ,其中将组织工程技术列为第三类医疗技术临床应用管理范围,我们在国内率先开展了组织工程气管临床试验研究。

试验入组标准

  1. 气管肿瘤,或周围器官肿瘤累及气管,切除范围超过6公分,无法实施传统端端吻合的患者。

  2. 肺癌侵犯第1,2级支气管,无法实施传统支气管成型或袖型切除,需要实施全肺切除患者。通过组织工程化气管替代品替代支气管,保全肺叶。

经典案例介绍如下

男性,57岁,主诉咳嗽,伴呼吸困难,于2015年至上海胸科医院就诊。胸部ct提示左上叶肺门处团块影,累及左主支气管伴左下叶阻塞性肺炎。PET检查与头颅MRI检查提示无远处转移。支气管镜检查发现:距隆突2厘米处,新生物完全阻塞左主支气管。(图1)气管镜活检病理提示:鳞状上皮细胞癌。该患者病情进展迅速,伴咯血及左全肺不张。经过肿瘤科内多学科讨论后,认为患者并不适合化疗或放疗,且生存期预计不到3个月。2015年2月5日,经我院伦理委员会审批同意,患者签署术前知情同意书后,我们实施挽救性手术,必要时行组织工程化气管置换术以保留患者左下肺叶。

图1 患者胸部CT提示中央型肺癌,气管镜报告肿瘤距离隆突2公分

手术过程

全麻后,施行常规开胸术,左上叶和左下叶背段、左主支气管切缘,病理提示均为阴性。5公分长的气管替代物连接左下叶基底段和隆突。两个PORT-A-CATCH植入式给药装置,其导管一端植入到气管替代物的两层脱细胞基质之间。另一端导管穿过胸壁,于体外连接两个埋于左侧胸壁皮下的输液港。替代物两端用肋间肌包绕。试水鼓肺,确保无气体渗漏。关胸前施行淋巴结清扫术。

术后,通过蝶翼针穿刺,连接埋于皮下输液港和两个体外输液泵。一个输液泵输入乳酸林格纳溶液(内含100 ug/ml庆大霉素),灌洗气管替代物,另一个输液泵输出灌注液。两个输液泵的流速均设定为10 ml/h。

术后治疗

术后,患者转入外科重症监护室,次日清晨拔出气管插管。患者能够自主呼吸,且胸片提示左下叶基底段扩张完全。乳酸林格纳溶液持续灌注一个月,并且每天收集灌注液,保存于低温冰箱中用于后续血管再生因子检测。术后第三天,我们采集20毫升外周血,用Res-QTM 60 分离器,收集全血中有核细胞。有核细胞(数量为0.9-1.3×10*8个)通过PORT-A-CATCH输液港回输到气管替代物中,回输治疗每周两次,于周一和周四,持续一个月。

患者术后恢复良好,并于术后一周转入普通病房。术后进行良好的康复训练,肺功能好于术前10%,患者于术后一月出院并于门诊随访。

术后两周、1个月、2个月、3个月、4个月均复查支气管镜检查。观察再血管化过程与ADM基质生物降解过程。四月后的气管镜活检病理证实气管替代物的上皮再生化的发生。(图2)


图2. 术后第三月气管镜随访,基底段吻合口通畅,组织工程化气管内侧猪真皮脱细胞基质降解伴随再血管化。

术后病理结果证实IIIA期肺鳞癌,伴纵隔淋巴结肿大。术后6个月复查CT提示纵隔淋巴结转移,肿瘤复发。患者拒绝EBUS或纵隔镜活检以确诊是否转移。我们建议患者先行两个周期DP方案(多西他赛联合顺铂)化疗和总计量30Gy的放疗。但患者因严重的呕吐反应故终止辅助化疗,在EGFR基因检测结果阴性的前提下,自行服用TKI药物特罗凯,150mg,每天一次。患者于术后13个月因肿瘤复发过世,非气管替代品引起并发症。

灌注液血管再生化检测

每个四个小时收集输液泵流出的灌注液,并通过Ciraplex™ 技术,及ELISA方法进行监测。Ciraples™技术基于化学荧光和抗体探针技术检测混合液中微量蛋白质浓度。我们在收集的灌注液样本中发现多种再血管化相关生长因子,鉴于临床中我们并为在灌注液中加入任何生长因子,所有生长因子应该来源于反复接种的种子细胞,间接的验证了体内生物反应器设计维持了种子细胞活性及正常功能。(图3)


图3. 组织工程化气管灌注液体中检测到再血管化相关生长因子:PLGF  placental growth factor人胎盘生长因子, HGF hepatocyte growth factor 肝细胞生长因子, PDGF-BB Platelet-derived Growth Factor BB人血小板源性生长因子BB, VEGF Vascular Endothelia Growth Factor人血管内皮生长因子, FGF-b Human Fibroblast Growth Factor-basic人碱性成纤维细胞因子, Ang-2 Recombinant Human Angiopoietin-2人促血管生成素2, HB-EGF Heparin-binding EGF-like Growth Factor肝素结合性表皮生长因子

该例患者是组织工程化气管首次应用于肺癌治疗,首例组织工程替代品植入患者接受放化疗,首次证明接种的种子细胞具有分泌生长因子促经再血管化功能。

综上所述,组织工程再生医学是外科发展的必然方向。人们将外科发展总结为5个R,Resect(切除), Repair(自体组织修复), Replace(移植), Regeneration(再生医学), Recovery(功能康复)。我们正逐步由器官移植迈入再生医学组织工程新纪元,组织工程气管的相关技术发展,对于其他组织器官的构建具有极大的指导和借鉴作用,是外科最前沿技术的代表。

参考文献:此处略

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