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肺癌转移到中枢神经系统的分子机制|AME《肺癌》连载010

Published at: 2015年第1卷第S1期

Timothy等
关键词:

Author: Timothy G. Whitsett 1 , Landon J. Inge 2 , Harshil D. Dhruv 1 , Philip Y. Cheung 1 , Glen J. Weiss 3 , Ross M. Bremner 2 , Jeffrey A. Winkles 4 , Nhan L. Tran 1

1 Cancer and Cell Biology Division, The Translational Genomics Research Institute (TGen), Phoenix, AZ, USA

2 Center for Thoracic and Esophageal Disease, Heart and Lung Institute, St. Joseph’s Hospital and Medical Center, Phoenix, AZ, USA

3 Cancer and Cell Biology Division, The Translational Genomics Research Institute (TGen), Phoenix, AZ, USA; Medical Oncology, Cancer Treatment Centers of America, Goodyear, AZ, USA

4 Departments of Surgery and Physiology, Center for Vascular and Inflammatory Diseases and the Greenebaum Cancer Center, University of Maryland School of Medicine, Baltimore, MD, USA

肺癌和中枢神经系统转移总论

2013年美国肺癌患病人数达246,000人,死亡164,000人(1)。在世界范围内,每年有1,500,000人死于肺癌(2)。进展期肺癌五年生存率不到10%(3)。进展期肺癌是最有可能播散到中枢神经系统的肿瘤类型。据估计诊断为小细胞癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)病人中,50%病人会出现脑转移。有趣的是,肺癌的不同组织学亚型扩散到CNS发生率不同(表1)。如SCLC,10%以上的小细胞肺癌病人临床上表现为CNS累及(10)。发生CNS转移患者生存率很低,约3-6个月。因此,提高进展期肺癌病人的治疗效果需要对转移性疾病尤其是脑转移的认识和治疗措施。

脑转移性病变是原发性病变的10倍,且所有CNS转移性疾病50%来自于肺(11,12)。CNS转移不仅具有较高的发病率和致死率,而且还可引起急性神经功能障碍, 认知损害和癫痫(12,13)。令人惊讶的是,由于人口老龄化、认知警告症状出现后CNS筛查增加和全身性疾病治疗的改进等因素的影响,CNS转移的发生率似乎在上升(12)。鉴于血脑屏障限制了许多治疗性药物尤其是大分子量抗体进入颅内,使得大脑转移灶成为治疗干预的唯一挑战。基于理解CNS转移的分子机制的治疗措施将不得不克服许多其他扩散性肿瘤位置不曾面对的困难。

伴CNS转移的原发性肺癌临床处理

转移性肺癌的临床处理仍面临极大的挑战。具体来说,大多数肺癌病人(约50%)被诊断时伴有局部或远处转移,中位生存期为7-11个月(14-16)。大脑是NSCLC 病人转移的常见部位,约25-30%的病人诊断时已有脑转移,大多数病人(40-50%)在病程中发展成脑转移(14-16)。脑转移病人预后差,这些病人采用姑息性皮质类固醇治疗的总体生存期为2个月(14-16)。尽管以铂类为基础的治疗对其他部位NSCLC转移有效,但这些药物由于不能有效地穿过血脑屏障而对转移性NSCLC脑病灶作用有限(16)。假如放疗与选择的全身性治疗效果一样,放疗则可作为脑转移的治疗选择。然而,即使采用放疗,生存率仍然较低,中位生存期为7.6个月(16)。另外,少数NSCLC病人(7%)在开始诊断或复发时出现孤立性脑转移灶(14,15,17)。这些病人的治疗方法是不同的,初步处理集中于脑转移病变。有研究资料显示对脑转移病变采用手术切除及全脑放疗,随后对NSCLC原发灶进行标准治疗(手术,手术加辅助化/放疗),可以改善这些病人的生存期,使中位生存期从2个月提高到7-27个月(14,15,17)。最近研究表明,EGFR基因突变的肺腺癌病人进行靶向治疗可以控制脑转移(16,18),提示靶向治疗对中枢神经系统转移有治疗价值。由于肺癌脑转移死亡率高,临床上迫切需要认识肺癌脑转移的机制,以便于我们能够找到治疗靶点。

与肺癌CNS转移有关的基因机制

Hanahan 和 Weinberg发现基因组不稳定性和突变是癌细胞的重要特征(19)。在癌变过程中,细胞发生几种基因改变,如突变,基因缺失,拷贝数异常或染色体重排,这些与从癌前病变向浸润性癌转变及最后进展至远处转移有关(20,21)。尽管肺癌是最常见的转移至脑的原发灶(22),但有关与肺癌CNS转移的基因异常了解甚少。下面概述目前文献中报道的关于原发和相应的CNS转移性肺癌标本中基因异常的数据(表2)。

体细胞基因突变与CNS转移

在大多数肺癌研究中,为了阐明肺癌的基因基础,在肺原发灶中发现了一些体细胞突变(包括EGFR,KRAS,TP53及其它)(35-41)。肺癌亚型的基因谱改变正通过新一代测序技术被研究,以便了解驱动性突变(42-45)。然而,很少研究调查了配对的原发性病变和转移灶,并对肿瘤的转移潜力和体细胞突变之间的关系进行了研究。此外,配对的原发和转移灶样本的研究仅主要集中于EGFR 或KRAS的突变状态。关于EGFR研究,Burel-Vandenbos等在最近的一篇综述中完整地总结了EGFR在肺癌脑转移中的突变状态(23)。在东亚人群中,已知有较高的EGFR突变率,在44-63%的脑转移灶中发现激活突变。高加索人群中,EGFR突变率较低,脑转移灶中仅有0-2%发现激活突变。Eichler和同事证实发生脑转移的肺癌病人,其原发灶中更容易出现EGFR突变(24)。病人配对的原发灶和脑转移灶EGFR突变的研究很少。4个小样本研究表明原发灶和脑转移灶中EGFR突变率不一致率为0-32%(23)。有人报道CNS转移灶中有EGFR突变,而相应的原发灶中未见突变(25),然而基因突变技术方面的影响因素仍不能排除。

关于原发性肺癌与相应的脑转移中KRAS突变状态的研究数据很少。Cortot 等报道13个脑转移病人中2例证实有KRAS密码子12的突变(G12C)(27)。在2例KRAS突变病人中,一例病人在原发灶和脑转移灶中均发现KRAS突变,而另外一例仅在转移部位出现KRAS突变。然而,他们不能使用直接测序方法,而是采用突变体富集PCR方法在1例病人中证实有获得性突变。然而,Kalikaki等在相似的研究中使用2个有原发灶和转移灶相对应的样本进行研究,发现1例脑转移样本中出现KRAS密码子12(G12S)的突变,对应的原发灶中没有突变(25)。Matsumoto等发现在19个转移性肿瘤中有2个存在KRAS突变(28)。然而,他们没有获取对应的原发性肺部肿瘤进行KRAS突变分析。最后,Munfus-McCray和同事等在最近的研究中发现23.5%的被分析的肺癌脑转移灶中有KRAS突变(29)。

总之,目前数据没有在原发性肺癌的EGFR 和KRAS突变状态和中枢神经系统转移之间建立任何明确的相关性。对原发灶的基因突变与可能的CNS转移之间的相关性仍需进一步研究。

与CNS转移相关的染色体不平衡

虽然下一代基因测序和以阵列为基础的比较基因组杂交的出现,但检测与肺癌脑转移相关的基因异常的研究还较少。在其中首次这类研究中,Shiseki等采用限制性片段长度多态性(RFLP)技术检测了43个病人(10个配对的原发和脑转移灶标本)中22个脑转移灶和23个早期肺癌原发灶中10个染色体40个位点的等位基因缺失(30,31)。他们证实在脑转移灶中2q、18q、22q染色体等位基因缺失(>60%)的发生率明显增多(P<0.05)。Takahashi等使用SNP阵列分析方法对8个肺原发灶和相应的14个转移灶、8个对应的正常肺组织进行了研究(34)。在5个肺原发肿瘤和相应的7个脑转移灶中,大多数(≥81%) 原发灶和相应的转移的灶中等位基因异常是相似的。当基因异常仅发生于转移性灶中时,11p15的等位基因缺失是最常观察的基因异常。Lee和他的同事在最近的研究中采用分子倒置探针(MIP)技术检测18个原发灶和对应的脑转移灶中的拷贝数异常(33)。使用比较MIP技术,他们发现原发性肺腺癌中5q35、10q23和17q23-24染色质区扩增与早期脑转移有明显相关性。

Sun等使用FISH技术研究了NSCLC原发灶和相应的脑转移灶EGFR基因拷贝变化,证实基因拷贝数增多存在于NSCLC原发灶(62%)和脑转移灶(64%)中(26)。而且,原发灶和相应的脑转移灶中EGFR基因拷贝数状态具有高度的一致性(84%)。相反,9例病人(16%)证实原发灶和相应脑转移灶中EGFR基因拷贝状态不一致,其中6例脑转移灶中有基因拷贝数获得。

Wrage 等使用aCGH发现与未发生骨转移的病人相比,有骨髓转移(骨髓中检测到播散的肿瘤细胞)的肺癌病人4q12-q32缺失,表明4q在转移中发挥作用(32)。此外,他们对36例脑转移灶微阵列进行了4q21的FISH分析,证实39%的样本中存在4q的一个等位基因缺失,而其获得仅见于6%的肿瘤中(32)。对43例原发肺癌标本和35例脑转移瘤进行广泛的FISH分析,发现与原发性肺部肿瘤相比,脑转移瘤中存在明显的4q21缺失。这一研究表明4q染色体上可能存在一个肺癌转移至脑的转移抑制基因。

总之,尽管多个基因异常被报道于肺癌脑转移中,但这些研究结果一致性较差,数据也很少。应用肺原发灶与对应的脑转移灶的大样本下一代基因测序计划可鉴定出驱动脑转移的新的基因异常,可用于了解病人预后和指导治疗选择。

CNS转移的相关分子机制

尽管肺癌脑转移的发生率很高,其发生机制尚不清楚。这里我们将讨论人临床样本或肿瘤生长和转移的小鼠模型中与CNS脑转移有关的基因和/或标记物。

临床样本中与CNS转移有关的基因

Kargi等检测了30例NSCLC包括15例切除的脑转移标本,发现CD44蛋白和转移潜力呈明显负相关(46)。CD44异构体在细胞黏附中具有重要作用,在多种类型的肿瘤中表达失调(47)。Kikuchi及其同事对16个脑转移灶和37个原发性NSCLC标本进行了对照研究,发现二者中有244个基因表达明显差异(48)。在转移灶中细胞骨架蛋白和与细胞运动有关的基因如金属硫蛋白2A(MT2A)、Fascin同源物3(FSCN3)、微管相关蛋白7(MAP7)和CXCL13等明显表达上调。Grinberg-Rashi 等分析了142例NSCLC 标本,发现N-cadherin、驱动蛋白家族成员1(KIFC1)和BPTF/FALZ表达可预测脑转移(49)。N-Cadherin在脑转移灶中过表达。该蛋白与细胞-间质转化和细胞侵袭有关(50)。此外,最近的研究显示E-cadherin表达缺失与脑转移有明显相关性(51)。在随访期间出现脑转移的NSCLC病人与未发生脑转移的病人相比,E-cadherin表达水平降低。最后,KIF1C,一种与细胞运动有关的kinesin家族成员(52),也在脑转移灶中过表达,而FALZ,一种与染色质重构有关的转录因子(53),在脑转移灶中表达下调。

另一种与肿瘤细胞迁移和侵袭明显相关的基因家族是趋化因子受体。趋化因子受体及其相应配体在多种恶性肿瘤中表达上调,被证实在多种原发肿瘤转移中起重要的、非冗余的作用[见综述(54)]。这样,趋化因子受体在肺癌转移至CNS具有重要作用。在32例NSCLC引起的孤立性脑转移灶中,90%原发灶和100%脑转移灶表达CXCR4,明显高于无远处转移的NSCLC或原发性脑肿瘤(55)。另一个与肺癌及转移播散有关的趋化因子受体是CX3CR1。CX3CR1蛋白在NSCLC中表达高于SCLC(56)。尽管CX3CR1阳性表达与转移灶数目明显相关,但自相矛盾的是CX3CR1阴性的肺腺癌更易于发生脑转移。上述研究表明来自于肺的CNS克隆性转移是一个复杂的过程,涉及到在细胞迁移和浸润中发挥作用的许多基因的失调。

组成性酪氨酸激酶活化在肿瘤生物学中的作用已较为明确。肺癌中许多研究聚焦于ERBB 家族成员,尤其是EGFR。这种受体通过突变或扩增导致的失调是某些肺癌一种已知的驱动因子,并成为一种前沿性治疗靶点。ERBB受体在脑转移中的作用还不甚清楚。已有研究表明ERBB2在乳腺癌中的表达与预后不良和脑转移有关(57-59)。Sun和同事检测了EGFR、ERBB2、ERBB3及其配体在50 例原发性NSCLC及相应的脑转移灶中的表达(26)。转移灶显示EGF和双调蛋白在细胞核中明显上调表达。与原发灶相比,磷酸化的EGFR和ERBB3在脑转移灶细胞膜表达增加。相反,与脑转移灶相比,TGF-α和神经调节蛋白在原发灶中的表达明显上调。因此,ERBB家族成员及其配体在原发灶与脑转移灶中表达存在差异。在另一项研究中,应用反相蛋白芯片法检测了42例乳腺癌和肺癌脑转移灶中128个信号蛋白的磷酸化状态,结果显示NSCLC转移灶中EGFR/ERK通路的表达水平相对升高(60)。与肺癌转移灶相比,乳腺癌转移灶的ERBB2/IGFR-Akt活性升高。因此,EGFR在肺癌脑转移中似乎发挥重要作用,这一通路作为治疗靶点目前正在研究中。

另一个与肿瘤细胞侵袭和转移有关的酪氨酸激酶受体是肝细胞生长因子受体(c-MET)。c-MET及其配体肝细胞生长因子(HGF),与多种实体肿瘤的肿瘤进展和转移有关(61)。c-MET蛋白表达见于约30%的腺癌,c-MET基因扩增见于10%的腺癌(62)。KRAS癌基因激活使c-MET活性增加(63),而c-MET基因扩增经常与EGFR酪氨酸激酶激酶抑制剂(TKIs)耐药有关。c-MET和/或HGF 表达与酪氨酸激酶激酶抑制剂(64-66)、顺铂(67)和放疗(68)抵抗有关,c-MET表达更常见于分化差的腺癌(62)。Benedettini等证实c-MET表达和磷酸化与脑转移有关,在脑转移灶中的表达较原发灶中高(69)。因此,HGF/c-MET通路为脑转移提供了独特的治疗靶点。

在SCLC这一高度侵袭性和最易出现脑转移的肺癌亚型中,近来有研究发现胎盘生长因子(PLGF)和血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)表达水平与脑转移相关(70)。有脑转移的SCLC 病人PLGF的血清水平较没有脑转移者高。PLGF表达升高也见于脑转移灶中。体外实验发现PLGF诱发VEGFR1信号表达和促进SCLC细胞跨内皮迁移。体内动物模型研究显示通过shRNA技术敲除PLGF可抑制脑转移。因此,VEGF成员PLGF在可能在SCLC的侵袭性特征中发挥作用。

小鼠模型中与中枢神经系统转移有关的基因

转基因鼠技术成为研究基因在发育和疾病病理尤其是癌症中作用的一种强有力工具。用条件等位基因或转基因方法控制人NSCLC的基因表达,构建了许多基因改造鼠模型(GEMM)(71)。在肿瘤抑制基因如TP53、P16或LKB1缺失存在或不存在的情况下,构建了几种携带NSCLC突变癌基因(如EGFRL858R,T790M,ERBB2YVMA,EML4-ALK嵌合体,PIK3CAH1074R,KRASG12V,c-MET)的GEMM鼠模型(71)。这些GEMM鼠模型可以转移至淋巴结,胸膜腔甚至远处器官如骨等(72)。尽管这些模型具有侵袭性,但CNS转移性克隆还未出现。CNS转移的缺乏可能是由于这些侵袭性模型生存期短,或无SCLC模型,即最易于出现CNS转移的组织学亚型。观察SCC或SCLC特异性癌基因突变的表达能否形成肺癌细胞向脑转移的GEMMs将很有意义。

尽管目前为止脑转移的GEMM模型尚未建立,但是已经建立了具备CNS转移特征的许多细胞株模型(同源和异种移植)。这些模型使用了多种注射方式,包括心内注射和肺原位注射。两个研究小组报告了A549肺癌细胞当通过血液注射或原位种植到免疫缺陷鼠肺内时,在脑组织中形成克隆的能力(73,74)。另一种被报道有脑转移表型的细胞株是NCI-H250,为小细胞肺癌模型(70)。将H250细胞注入颈内动脉,18只小鼠中5只出现脑转移,抑制PLGF的活性可彻底消除脑转移。在小鼠模型中使用人细胞株的缺点是没有完整的免疫应答。为了克服这种困难,有研究者使用Lewis肺癌细胞(LLC)制作了同基因小鼠模型。这些细胞有能力从原位注射部位向多个器官远处转移,包括发生率较低的脑转移(75)。LLC细胞注入颈内动脉也能产生脑转移(76)。

许多实验室建立了多种类型肿瘤的多个特定部位的转移模型。体内选择有脑转移潜力的肺癌细胞,进行提取/扩增培养,再植入体内,有可能产生脑转移能力升高的亚细胞亚克隆。2004 年,Yoshimasu等描述了用SCC细胞株EBC-1构建的CNS体内转移模型(77)。亲代EBC-1细胞心室注射后同时出现脑转移和骨转移的几率不高。把这些转移细胞提取出来,在体内重复选择,产生了脑转移或骨转移能力升高的EBC-1亚克隆。这些脑转移能力强的EBC-1亚克隆与EBC-1亲代细胞或骨转移的EBC-1细胞相比,明显地高表达整合素α-3(77)。体内实验表明抑制整合素α-3/beta-1明显降低了脑转移能力。ADAM9是“解聚素和金属蛋白酶”家族的成员之一,也与NSCLC脑转移有关。ADAM 家族成员调控细胞-细胞和细胞-基质相互作用(78,79),与亲代和骨转移细胞株相比,ADAM9 mRNA在EBC-1脑转移细胞株中高表达(73)。ADAM9在A549细胞株中过表达增强了细胞在脑组织中形成微转移灶的能力。另一个有脑转移能力的SCC细胞株是HARA(80)。而且,心内注射发生脑转移后进行体内选择产生脑转移能力提高的亚克隆细胞株。这种体内模型被用来了解星形胶质细胞和转移细胞之间的招募和相互作用(81)。

Massague实验室建立了多种类型肿瘤的多个特定部位的转移模型。用H2030 a PC9细胞(分别为KRAS和EGFR突变的腺癌细胞),进行心内注射,对脑转移灶组织培养后进行提取和扩增,进行多轮选择后产生有100%种植到脑的细胞(82)。这种模型的特点之一是异位种植入肺的细胞可形成脑转移。与亲代细胞株相比,有脑转移能力的细胞株WNT/TCF 信号通路增强。这条通路中与转移有关的基因是LEF1、HOXB9、BMP4。LEF1或HOXB9的敲除可明显降低脑转移细胞株形成转移灶的能力。Huang及其同事利用PC9脑转移细胞株中检测针对EGFR和uPAR的毒性(83)。他们发现注射免疫毒素可延长小鼠的生存期。

microRNA在脑转移中的作用

与CNS转移有关的miRNA

miRNAs是非编码内源性RNA,在转录后水平调控基因表达(84)。miRNA失调与多种肿瘤的发生和进展有关,但miRNA在CNS转移中的作用仍是新的研究领域。miRNAs在组织和体液中的稳定性使他们成为可以预测疗效和判断预后的引人注目的候选标志(85,86)。多个研究小组发现miRNA可以作为标志物用于病人分层或确定CNS转移。为了寻找预测复发和无病生存期的标志物,Lu 等对I期肺癌术后标本中提取的miRNA表达谱进行了研究(87)。他们发现有10个miRNA差异表达于发生脑转移的样本中,它们为miR-1,-29c,-30d,-145*, -148a*,-187,-218,-375,-450b-3p和-708。为了检测和区分CNS恶性肿瘤,Teplyuk等研究了脑脊液中miRNA表达(88)。结果发现miR-200家族成员(包括miR-141和miR-200a/b/c)高度表达于乳腺癌或肺癌转移的脑脊液中,而不见于其他恶性肿瘤。最近,Arora等证实miR-328和miR-330-3p表达可明显区分7例有脑转移的病人与6例无脑转移的病人(89)。因此,miRNA表达谱有助于发现易于发生脑转移的肺癌。

与miRNA功能有关的CNS转移机制

很多研究致力于阐明miRNA在脑转移表型中的作用机制。如有研究报道,miR-378可以通过MMP2、MMP9和VEGF促进A549细胞的生长,侵袭和迁移(90)。Arora等发现miR-328过表达通过调节PRKCA这一VEGF-IL1家族成员促进NSCLC迁移(89)。Cheng等发现IL1-beta通过PRKCA依赖性机制促进A549细胞的uPA表达和细胞迁移(91)。其他研究人员发现miR-146a可发挥机制上相似于抑制转移功能(92)。miR-146a过表达抑制b-catenin的降解,抑制hnRNPC,反过来减少uPA、uPAR、MT1-MMP and MMP1表达。b-catenin上调表达和hnRNPC抑制都可抑制侵袭和转移。miRNA在肺癌向CNS转移中的作用仅仅刚刚起步,可能为晚期肺癌治疗提供新的靶点。

CNS转移的治疗机会

迫切需要提供出现或发展CNS转移的原发性肺癌病人的临床结局。随着原发性肺癌全身性治疗和影像检查手段的进步,CNS转移的发生率和检出率将进一步增加。目前手术加放疗(针对孤立性脑部病灶)或针对多个病灶放疗的治疗方案成功率不高。针对与CNS转移有关的靶点的抑制性药物列在表3中。靶向药物治疗EGFR突变的CNS转移(97)的临床获益已得到证实,并且增加了对CNS转移表型的基因和分子机制的了解。针对其他ERBB家族成员的靶向治疗可能也证明了是肺癌或乳腺癌CNS转移的有效治疗策略(26)。来自于表达突变KRAS的原发灶出现CNS转移时可能对MAPK和PI3K或SRC抑制剂的联合治疗敏感。c-MET表达与CNS转移有关,打开了探索c-MET抑制剂治疗的可能性(98,99)。因此,通过收集病人配对的原发和转移性标本进行研究以及继续构建能够忠实模拟肺癌CNS转移动物模型,进一步了解CNS转移的驱动机制非常重要。检测这些药物穿过血脑屏障影响希望的靶点的能力也很重要。

结论

肺癌仍然是全世界癌症相关性死亡最主要的原因。进展期特别是转移性肺癌的5年生存率极低。作为一个转移性部位的脑转移促使该病死亡率高,导致明显降低了生命预期。对来自于肺的CNS转移的遗传学和分子机制的彻底理解目前尚未完成。下一代测序技术结合病人配对的原发灶和CNS转移灶标本的收集为更加完全理解该转移性过程和新的治疗方法提供了一条道路。靶向EGFR突变的治疗明显影响CNS转移患者预后为我们提供了希望,那就是充分理解CNS转移性病变将导致更好的治疗和提供患者的生存。

致谢

声明:作者宣称没有利益冲突。

译者:臧家兰

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doi:

10.3978/kysj.2014.1.1314

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