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AME特邀来稿|血片技术筛查新生儿疾病的过去、现在和将来

Published at: 2015年第1卷第S1期

Kaustuv Bhattacharya , Tiffany Wotton , Veronica Wiley*
关键词:

【编者按】细菌生长抑制试验血片筛查技术应用于新生儿已有50多年,这次小科和大家分享的是由AME旗下Translational Pediatric杂志(简称TP)副主编、来自澳大利亚 The Children’s Hospital at Westmead 的吴占河教授和哈尔滨医科大学附属第一医院侯宇航医生翻译的精彩文章《血片技术筛查新生儿疾病的过去、现在和将来》,该文章出自吴占河教授在2014年所组的TP特刊 "Genomic studies of pediatrics" ,译稿已于今年四月发表在《诊断学理论与实践》,下面赶紧来品鉴一下这篇佳作吧!

作者

Kaustuv Bhattacharya,

Tiffany Wotton,

Veronica Wiley*

澳大利亚悉尼大学儿科系,澳大利亚新南威尔士洲新生儿筛查中心,2145

*注:文章作者之一Veronica Wiley为现届国际新生儿筛查学会主席。

本文译自Transl Pediatr,2014,3(2):63-70.

细菌生长抑制试验血片筛查技术应用于新生儿已有50多年。目前新生儿血片筛查已成为一项面向大众的检测。数十年来,随着疾病筛查及相应早期干预的开展,使全世界的苯丙酮尿症、先天性甲状腺功能减退、囊性纤维化和血红蛋白病患者从中获益。在过去20年里,实验室技术发生了巨大变化,随着高通量筛选数据处理方法的应用,可被识别、筛查出的疾病正逐渐增多,形成了一个庞大的疾病谱,而同时用于罕见病治疗的费用也将增加。部分检验技术已随点喷雾串联质谱分析等多元分析项目的应用而实现,但要将其推广则尚待时日。

医学筛查试验的目的是使用可靠的方法从目标人群中鉴别出有临床治疗意义的疾病患者,如采用适当的实验室检测技术可早期发现某些表面健康而实际患有先天性代谢异常及代谢紊乱的婴儿。完善的筛查系统应包括以下几点,①早期诊断能使患者明显受益;②检测试验应兼备较高的诊断特异度和灵敏度;③具备确诊疾病并利于疾病的咨询、治疗、随访的作用,可系统平衡各种利弊。在过去50年中,对无症状的婴儿进行重大疾病鉴别、筛查已达成了共识。随着科学技术的进步,各种各样的筛查项目逐步被纳入新生儿筛查的领域。

苯丙酮尿症(phenyketonuria,PKU)

1961,Robert Guthrie发明了可用于大规模筛查婴儿苯丙酮尿症的简易测试。1962年,其获得授权采用细菌生长抑制试验对400 000名婴儿进行苯丙酮尿症筛查研究,时段从1963年初开始到1963年12月31日止,美国有29个州及波多黎各都为此研究提供了相关数据。改检测方法是将婴儿血液浸染滤纸盘(血片),并将滤纸盘置于琼脂培养基中,血液中升高的苯丙氨酸将解除琼脂培养基中β-2-噻吩氨酸对枯草芽胞杆菌的生长抑制作用,故在苯丙酮尿症患儿血液滤纸盘周围,枯草芽胞杆菌生长良好。苯丙氨酸的水平近似值可经已知浓度的校正曲线判定。最初此项测试在一家医院内小范围内应用,但在很短时间内,越来越多的医院参与其中,并快速传播到美国各州及世界其他国家。Horst Bikel 等的报道也证实了Guthrie检测试验的成功,与Guthrie的论文发表10年前相比,苯丙酮尿症患儿因获得早期诊断,治疗效果显著提高。2位科学家随后表示,廉价可靠的筛查测试和行之有效的疾病辅助治疗是确保苯丙酮尿症筛查成功的关键。现在人们已经进一步意识到,治疗这种罕见的先天代谢缺陷不仅需要限制患儿饮食中的苯丙氨酸,同时也需要提供营养全面的健康饮食,以确保患儿的正常生长所需。当然,为达到良好的效果,必要的家庭支持也很重要。苯丙酮尿症是第一个开展系统筛查的疾病,通过大量观察所积累的经验,随后被以不同方式应用到其他疾病的筛选中。很显然,只有针对人口基数做好筛选计划之后,才能对此类疾病患者进行及时的诊断和处理。随着苯丙酮尿症筛查的成功,应用抑制试验原理,人们开发出了其他疾病诊断性测试,如高胱氨酸尿症和枫糖尿病。然而,尽管细菌生长抑制试验方法在人群筛查中取得了成功,但目前确诊苯丙酮尿症等疾病还需要使用其他技术协助检测[见本文中串联质谱(MSMS)在筛查中的应用]。

先天性甲状腺功能减退症

早在1970,人们就意识到先天性甲状腺功能减退症筛查工作的益处。如同经典的苯丙酮尿症一样,能致永久性严重神经性残疾的先天性甲状腺功能减退症在早期是隐匿的,直到患儿满周岁前后,症状才变得明显。最初有学者提出,可利用放射性技术进行先天性先天性甲状腺功能减退症的筛查。但直到1973年,才由Jean实现了应用血滤纸样本测定低水平甲状腺素(T4)的方法。然而,在T4检测中受累与未受累患儿间有明显重叠,相当比例的婴儿需要进一步行包括垂体激素和促甲状腺激素(thyrotropin,thyroid stimulating hormone,TSH)的测定,才能确诊。1974年至1975年间,先后开发了克用于测定TSH和T4血滤纸样本的放射免疫测定技术。随后,世界各地陆续研发了各种项目,但因其方法不同,而各自选取了不同的筛选策略,包括单独检测T4,单独检测TSH或T4与TSH联合检测。TSH在婴儿出生后第一个24h内会出现生理性激增,从而导致TSH检测的假阳性,因此在进行此项检测时,亦需结合年龄并加以全面考虑。与细菌生长抑制试验筛查相比不同的是,这些分析提供了定量结果,而不是半定量结果。这也导致了一场关于哪些患者需要筛选鉴定及相关质控和验证结果的争论。随着时间的推移,其检测的灵敏度得到了改善,筛查漏诊的病例也得到了确认。关于上述问题的争论,为如何确定T4或TSH临界值提供了有利的依据。目前看来,多数情况下的甲状腺功能减退可经以T4或TSH任一指标异常而被确诊,但详细的评估分析和相关的验证测试仍必不可少,以便排除由内分泌疾病及其他原因导致的垂体功能不全。

随着放射免疫测定法受到重视,其也开始被应用于慢性活动性肝炎和囊性纤维化疾病的筛查中。新生儿甲状腺功能减退的快速鉴定筛查大大改善了严重先天性甲状腺功能减退患儿的结局。随着婴儿疾病筛查项目的增加和对检测质量优化及自动化的需求上升,可提供一致的样本打孔质控和免疫测定设置的自动化仪器也出现了,其促进了高效自动化流程筛选,可使更多的被检者获益。

囊性纤维化

就筛查概念而言,实施囊性纤维化筛查需要转变常规思考模式。治疗囊性囊性纤维化患者,需要严格、综合性的管理,包括提高呼吸功能、及时治疗感染和优化营养等诸多学科共同参与。此外,一些囊性纤维化的患儿在1岁内的疾病表现并不明显,严重的并发症到儿童期才变得明显,因此产生了以下争论。相较待临床确诊后再进行干预治疗的患者,对开展以人群为基础德筛查而检出的患儿进行早期干预对患儿是否有益处,这场争论导致当时英国等国家推迟囊性纤维化的筛查,此后争论持续多年。但目前依据对囊性纤维化生存者的长期结局观察来看,囊性纤维化患者通常出现与临床相关的呼吸道感染或脂肪痢,患者体质非常脆弱,而早期诊断囊性纤维化,有利于预防疾病的恶化和推迟合并症的发生,可延长患者的生存时间。

在20世纪60年代早期,采用检测胎粪白蛋白水平的方法,使筛查新生儿囊性纤维化成为可能。然而,获得的样本如储存在室温下,或患儿具有正常胰腺功能均会使白蛋白含量下降,从而导致假阴性结果;与此相反,胰腺功能较差的早产儿或肠道闭锁的婴儿则可产生假阳性结果。1979年,囊性纤维化筛查的概念发生了转变,人们倾向于采用生物标志物(免疫反应性胰蛋白酶)进行筛查,而不是直接测定代谢产物(如新生儿采用干血片样本测定苯丙氨酸)。早期发表的论文显示,免疫反应性胰蛋白酶测定很难预测囊性纤维化。免疫反应性胰蛋白酶水平可能在围产期应激、先天性感染、肾衰竭、13或18三体综合征时上升,此外,出生2~5 d的婴儿也可能出现一个免疫反应性胰蛋白酶上升假象。同时研究显示,免疫反应性胰蛋白酶水平随着患儿年龄的增长而下降。因此,需要依据适当的年龄临界值来解释测定结果。为提高囊性纤维化筛选方法的特异度,不同年龄段需采用不同的标本采集方法,检测手段也多种多样。进而,如确认测试的有效性,还需要可靠的诊断测试,如汗液测试,该试验对验证新生儿筛查的有效性至关重要。1990年以来,一些研究发现了进一步的筛查方法,即采用跨膜电导调节蛋白突变检测来进行囊性纤维化的筛查,而针对突变的特异疗法地进步,使得检测更快、成本更低。至此,更有争议的问题出现了,少数被检出的婴儿为健康的囊性纤维化基因携带者,还有如采用免疫反应性胰蛋白酶测定,部分人群可能得到假阳性结果,这些情况将增加患儿或被检对象家庭的精神负担。当然,此类检测也将为患儿父母及其他家庭成员生育选择提供必要的信息。

串联质谱(MSMS)在筛查中的应用

在20世纪90年代之前,人们是采用单一的试验检测某种疾病。自动进样电喷雾MSMS技术的出现,因其具有高通量筛选功能,可同时识别多种代谢物的功能,故被应用于多种先天性代谢缺陷的检测中。MSMS可为疾病提供具有诊断意义的代谢产物变化信息,如测定苯丙酮尿症患者的重要代谢产物苯丙氨酸。本技术的优点是可确定代谢产物物质谱,如各种氨基酸和酰基肉碱都可在血片收集时测定。通过检测血液中代谢产物谱,不仅可鉴别苯丙酮尿症,也可鉴别中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症、枫糖尿病、Ⅱ型酪氨酸血症和线粒体三功能蛋白缺陷[掺入长链3羟酰基辅酶A脱氢酶(LCHAD)]。然而,该筛查方法也产生了新的问题,就是代谢产物谱受外在环境、条件的影响(包括采集样本时个体的年龄、喂养方案、父母的营养状况、样本储存的温度和时间),因此筛查不同的代谢产物的灵敏度和特异度需要考虑外部条件和情况,才能保证检测有效。如一些代谢产物如瓜氨酸或辛酰基肉毒碱在某些条件下会升高,代谢产物谱也需随之升高。

筛查检测注意事项

随着筛查技术的发展,世界各地经验不断汇总,各机构都需要有严格的算法以制定各种基础测试值,因此需注意以下问题。

一、界定适当的年龄范围(包括年龄和妊娠期)

目前对比不同机构间的数据仍较困难。如早产儿酪氨酸代谢物水平会升高,但短期后可恢复正常水平。在出生后的头几天,患儿有许多代谢产物值呈正常分布,特别是一些脂肪酸、酰基肉碱类,因此第一天收集的样本不能与出生第5天收集的样本进行比较。

二、疾病的定义与统一性

病例筛查的生化检测范围呈连续分布,故疾病诊断需要一个特定的临界值。如中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症等障碍,其中辛二酰肉碱的甄别阈范围为0.12~0.80μmol/L,提示人们使用不同的临界值判断阳性病例,缺乏统一标准。一些机构使用各种酰基肉碱的比率辅助诊断中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症,如采用辛二酰肉碱(C8)/癸酰基肉碱(C10)。

三、辅助检测手段

实验室检测主要的代谢产物是初步筛查,如使用相关的辅助检测手段检测同一样本,可明确地辨别不同疾病病因。如蛋氨酸升高可见于肝脏功能不全、甲硫氨酸腺苷转移酶缺乏、高胱氨酸血症等,就同一血样而言,所有高蛋氨酸的待检样本均可通过同型半胱氨酸雪片检测而发现生物化学成分区别。这里辅助检测手段不是验证测试,因为同型半胱氨酸可在多种不同情况下升高。

四、确证检测策略

对某些疾病而言,辅助检测手段也是确诊试验,如初步筛查发现总亮氨酸升高,可在第二次血片检查异亮氨酸。检测已知疾病的常见基因突变可用于疾病诊断,如ACADM基因突变。新南威尔士州的一家实验室,在培养的皮肤成纤维细胞中得到了特异性极长链酰基辅酶A脱氢酶,进而分析得出其可作为该酶缺乏症的确证试验。该方法为侵入性检测,且需耗时几个星期。全球范围内有几个单位采用ACADVL基因突变检测作为极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症的确证检测。但采用基因突变检测作确诊试验时,如发现只有一个序列变异或临床意义不明的某个变异,将导致难以判断所发现的变异是否致病。数据库注册信息的检索有助于判断变异,数据库注册包括临床数据中心所有的阳性病例和未出生的长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症患儿。随着时间的推移,相关资料的累积,病理性突变和良性多肽性可被区分。

五、非病理性变异的定义

事实证明,MSMS筛查挽救了许多中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症和枫糖尿病等疾病患者的生命。然而,现在人们也清楚地认识到检测物存在生化变异,如C4-和C5OH-肉碱,不一定与实际的疾病相关。在澳大利亚新南威尔士州,已停止短链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症的筛查,因该病患者与同龄人对比显示,患者无症状且不需要治疗。故人们开始考虑停止类似的其他检测项目,如3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶(3-MCCCC)缺乏症的筛查。尽管如此,以MSMS筛查为基础的方法已改变了新生儿筛查的格局,且其对众多检测结果能多方面地解释代谢的动态及复杂性。多数发达国家正考虑采用类似方法,以低廉支出来鉴别一系列的严重疾病。

其他疾病

澳大利亚现已提出以下关于新生儿血片筛查项目的问题及建议。血片筛查适用性的评估应该包括以下标准。①可证明有益或可能有益于早期诊断;②有合适的测试手段和治疗方法;③便于随访跟踪。技术使用带来的收益和成本支出,取决于疾病在该地区的发生频率和其他因素。

下列筛查项目可根据各地情况开展,即生物素酶缺乏症、半乳糖血症、血红蛋白病、重症联合性免疫缺陷。

目前,澳大利亚不推荐不具有一定筛查条件的筛查;或具有此条件但不具有早期诊断优势;或者筛查结果模棱两可,筛查试验没有价值;或筛查试验不适用;或可能筛查出疾病,但筛查方法不存在优势的筛查。

以下疾病筛查所得到的结果,需要规律检测,包括胆汁酸合成障碍、巨细胞病毒、杜氏肌萎缩症、家族性高胆固醇血症2、脆性X染色体综合症、6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺乏症、血色病及多数的溶酶体贮积障碍和弓形体病。

未来发展方向

2006年,美国医学遗传和基因组学会发表了各种新生儿疾病筛查范围的评估方法,严格、系统地评估了适应证范围。该方案通过咨询相关领域专家来评估每个个体的疾病是否入选,包括疾病不予治疗产生的后果、试验策略周期和成本、确证试验的实用性、简单的诊断和治疗,以确保早期干预对个体、家庭、社会及预防死亡都有益处。该反感使用一个标准化评分系统,结果提示,各种疾病中,中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症、苯丙酮尿症和先天性甲状腺功能减退排名最高。关于是否进行溶酶体贮积障碍筛查存在争议,而经对所有状况进行总结后发现,Fabry病和Krabbe病和糖原贮积症得分最低。同时,美国医学遗传和基因组学会也认为,婴儿糖原贮积症的治疗方法已取得成效,今后几年,糖原贮积症得分可能增高。然而,对Fabry病和Krabbe病缺乏可靠证据支持,即早期干预是否有效。多种溶酶体贮积障碍同时筛查,可减少晒查得成本,但困难的是如何针对个体的试验结果进行确证。

美国经系统研究和评估了重症联合性免疫缺陷后,最近将其加入全国筛查的范畴。随着越来越多的技术被有效应用,人们将有机会了解所有疾病的筛选条件及危险因素。目前,检测技术可支持筛查维生素B12缺乏等营养不良、巨细胞病毒感染或其他先天性疾病,如Duchene肌肉萎缩症或脆性X染色体综合征,这一系列疾病都需要对应的筛选结果已支持相关咨询和干预。基因定向筛查这一通用技术为证实这些疾病提供了真正的可能性。一些疾病正在考虑应用全基因组筛查这一万能手段,但随之会产生一定的问题,出现不能确定的情况和未被发现的疾病。基因筛查也可确定疾病发病风险,但无法确定个体一生的情况。所以当务之急是充分阐明全基因组或外显子组分析获得的所有信息最终用途。二代测序可用于检测疾病靶基因,以降低筛查的偶然风险,增加筛查范围。拥有庞大人口且幅员辽阔的国家,如中国及印度,在开展筛查工作时就需要考虑疾病的流行情况、治疗的合理性、受累个体所在的区域性,这的确是个巨大挑战。

在过去50年里,曾经使用简易新生儿血片的筛查已演化为当今最现代化的筛查技术。但就筛查技术而言,每个国家都需要意识到技术的应用地可能性和局限性,掌握如何按照自己的国情加以应用。

译者信息

侯宇航,哈尔滨医科大学附属第一医院血液科 ;

吴占河,澳大利亚亚历山大儿童医院

点击链接可免费阅读/下载该文章英文全文。http://www.thetp.org/article/view/3543/4406

Doi:10.3978/kysj.2014.1.724

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